引用本文
刘坤举, 张小辉, 庞有志, 赵淑娟, 祁艳霞, 王乾昆. 朝鲜鹌鹑 GNAS基因表达、克隆及其多态性与羽色的相关性 [J]. 浙江农业学报, 2020,32(8): 1369-1377.
LIU Kunju, ZHANG Xiaohui, PANG Youzhi, ZHAO Shujuan, QI Yanxia, WANG Qiankun. Relationship of plumage color with expression and polymorphism of GNAS gene in Korean quail [J]. ACTA AGRICULTURAE ZHEJIANGENSIS, 2020,32(8): 1369-1377.
Doi: 10.3969/j.issn.1004-1524.2020.08.06
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朝鲜鹌鹑 GNAS基因表达、克隆及其多态性与羽色的相关性
刘坤举1,2, 张小辉1,2,*, 庞有志1,2, 赵淑娟1,2, 祁艳霞1, 王乾昆1,2
1.河南科技大学 动物科技学院,河南 洛阳 471003
2.洛阳市动物遗传育种重点实验室,河南 洛阳 471003
*通信作者,张小辉, E-mail:zhangxiaohui78@126.com
作者简介:刘坤举(1993—),男,河南商丘人,硕士研究生,主要从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail:936960534@qq.com
收稿日期: 2020-01-05
基金资助: 企业合作项目“蛋用鹌鹑配套技术研究与种源基地建设”(22010090)
摘要
为了研究朝鲜鹌鹑 GNAS基因表达和多态性与羽色的相关性,取栗羽和白羽朝鲜鹌鹑不同发育时期胚胎翅尖组织,采用Trizol法提取总RNA,实时荧光定量PCR检测 GNAS基因在朝鲜鹌鹑胚胎发育不同阶段和不同羽色鹌鹑胚胎翅组织中mRNA的表达水平;克隆 GNAS基因的CDS全序列并进行生物信息学分析;采集孵化至10 d胚胎翅尖组织提取基因组DNA,PCR扩增 GNAS基因的特定序列,通过不对称PCR-SSCP方法结合测序确定基因型,分析不同基因型对朝鲜鹌鹑羽色形成的影响。结果表明,胚胎发育8~14 d时, GNAS基因在栗羽鹌鹑胚胎组织中的表达水平极显著( P<0.01)高于白羽鹌鹑胚胎。 GNAS基因CDS区开放阅读框长1 140 bp,含有14个外显子,编码含379个氨基酸的稳定性亲水蛋白。在朝鲜鹌鹑 GNAS基因中检测到2个SNP位点,分别为外显子12区域的g.119221T>A和3'UTR区域的g.121181A>G。栗羽朝鲜鹌鹑的3种基因型(AA、 AB和BB)的频率分布与白羽朝鲜鹌鹑存在极显著差异( P<0.01)。结论表明,朝鲜鹌鹑组织中 GNAS基因的表达量高低与其羽色的形成有一定的关系, GNAS基因3'UTR上的g.121181A>G位点突变与朝鲜鹌鹑羽色性状之间具有显著关联性,可作为研究朝鲜鹌鹑羽色的一个候选基因。
关键词:
朝鲜鹌鹑; GNAS基因; 羽色; 基因表达; 基因突变
中图分类号:S839
文献标志码:A
文章编号:1004-1524(2020)08-1369-09
Relationship of plumage color with expression and polymorphism of GNAS gene in Korean quail
LIU Kunju1,2, ZHANG Xiaohui1,2,*, PANG Youzhi1,2, ZHAO Shujuan1,2, QI Yanxia1, WANG Qiankun1,2
1. College of Animal Science, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China
2. Luoyang Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding, Luoyang 471003, China
Abstract
The present study was undertaken to explore the correlation between GNAS gene expression, polymorphism and plumage color in Korean quail. Trizol method was used to extract total RNA from different wing tip tissues of maroon Korean quail embryos and white Korean quail embryos at different development stages, and RT-qPCR was used to detect the mRNA expression level of GNAS gene in wing tissues of Korean quail embryos at different development stages and different feather colors; The full CDS sequence of the GNAS gene was cloned and analyzed by bioinformatics; Genomic DNA was extracted from wing tip tissue of embryos, incubated for 10 days, and the specific sequence of the GNAS gene was amplified by PCR. Asymmetrical PCR-SSCP method combined with sequencing was used to determine the genotype to analyze the effect of different genotypes on the formation of plumage color in Korean quail. The results showed that the expression level of GNAS gene in maroon quail embryos was significantly higher ( P<0.01) than that in white quail embryos at 8-14 days. The open reading frame of the CDS region of the GNAS gene is 1 140 bp in length, contains 14 exons, and encodes a stable hydrophilic protein containing 379 amino acids. Two SNP loci were detected in the Korean quail GNAS gene, namely g.119221T>A in exon 12 region and g.121181A>G in 3'UTR region. The frequency distribution of the three genotypes (AA, AB and BB) of maroon plumage Korean quail in g.121181A>G mutation site in 3'UTR region was significantly different from that of white plumage Korean quail ( P<0.01). These results suggest that the expression level of GNAS gene in Korean quail tissue was related to the formation of plumage color. The g.121181A>G mutation on the 3'UTR of the GNAS gene had a significant correlation with the plumage color traits of Korean quail. GNAS can be used as a candidate gene for studying plumage color of Korean quail.
Keyword:
Korean quail; GNAS gene; plumage color; gene expression; gene mutation
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羽色是家禽重要的质量性状, 其遗传效应是近年来研究的热点。黑色素的数量、性质与分布是导致家禽羽色多样性的重要原因[1]。作为羽色形成的基本物质, 黑色素可分为真黑素和褐黑素。真黑素包括黑色和褐色, 褐黑素包括黄色和红色, 2种黑色素之间的相互转化影响羽色的形成[2]。影响黑色素形成的基因有很多, 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α 亚基(guanine nucleotide-binding protein Gs subunit alpha, GNAS)是位于细胞膜内侧的一类信号传导蛋白, 参与细胞的多种生命活动[3]。在黑色素代谢通路中, GNAS与黑素皮质素受体1(melanocortin receptor-1, MC1R)通过跨膜结构结合, 激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, ADCY), 催化ATP产生第二信使, 影响细胞内黑色素的合成[4]。
GNAS基因是影响乌骨鸡黑色素沉积的候选基因, 该基因位于20号染色体Fm区域的拷贝数重复区(copy number variations, CNVs)内, 与黑色素的沉积密切相关[5]。已有学者发现, GNAS基因突变可能会导致人类患黑色素瘤病[6, 7]。综上, GNAS基因可能与黑色素形成有关。
本研究采用实时荧光定量PCR技术探究栗羽和白羽朝鲜鹌鹑不同胚胎发育阶段GNAS基因的mRNA相对表达量, 并对GNAS基因单核苷酸多态位点(single nucleotide polymorphisms, SNPs)进行检测, 分析SNPs与朝鲜鹌鹑羽色性状之间的关联性, 旨在为探究朝鲜鹌鹑及其他禽类羽色形成、变化等研究提供参考。
1 材料与方法1.1 试验材料栗羽和白羽朝鲜鹌鹑受精蛋购自市场。取栗羽和白羽朝鲜鹌鹑受精蛋各60枚进行孵化, 取孵化至6、8、10、12、14 d的鹌鹑胚胎翅尖组织置于液氮中保存, 用于后续总RNA的提取; 取栗羽和白羽朝鲜鹌鹑受精蛋各300枚, 孵化至10 d, 取胚胎翅尖组织置于液氮中保存, 用于后续基因组DNA的提取。
1.2 主要试剂和仪器Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒、总RNA反转录试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、pMD-19T质粒载体、SYBR Green II RNA染料以及DL 2000 bp Maker均购置于北京索莱宝科技有限公司。
Nano Drop 2000C超微量分光光度计和冷冻高速离心机购于美国Thermo Fisher Scientific公司; 荧光定量PCR仪、梯度PCR仪、凝胶成像仪均购于美国BIO-RAD公司; 水平电泳槽和垂直电泳槽购于北京六一生物科技有限公司。
1.3 总RNA提取与反转录分别取栗羽和白羽朝鲜鹌鹑不同胚胎时期的翅尖组织, 将同羽色、同孵化期的3个样品混合, 用电动研磨器磨碎, 采用Trizol法提取总RNA。取1.5 μ L样品滴于超微量分光光度计上检测, 合格后将样品稀释至500 ng· μ L-1。取2 μ L稀释后RNA样品混合1 μ L 6× DNA Loading Buffer, 进行琼脂糖凝胶电泳, 检测总RNA的质量。
使用反转录试剂盒合成cDNA第一链。反应条件是:总RNA 3 μ L、gDNA remover 1 μ L、10× g DNA remover Buffer 1 μ L, 补RNase-free H2O至10 μ L, 42 ℃孵育2 min, 60℃孵育5 min。第二步的合成体系及反应条件是:dNTP Mix 1μ L、GoldenstarTM Oligo(dT)17 1 μ L、Randomer 1 μ L、5× GoldenstarTM Buffer 4 μ L、DTT 1 μ L、GoldenstarTM RT6 1 μ L、RNase-free H2O 2 μ L, 25 ℃孵育10 min, 55 ℃孵育40 min, 85 ℃孵育5 min, 产物置于-20 ℃保存。
1.4 基因组DNA提取与检测分别取栗羽和白羽朝鲜鹌鹑胚胎孵化至10 d时的翅尖组织, 使用基因组DNA抽提试剂盒进行提取。取1.5 μ L样品滴在超微量分光光度计上检测, 取4 μ L合格的DNA样品混合1 μ L 6× DNA Loading Buffer进行电泳, 检测基因组DNA的质量。
1.5 GNAS基因mRNA表达检测采用克隆获得的朝鲜鹌鹑GNAS基因序列设计引物mRNA序列信息, 用Beacon Designer 8.0软件设计引物, 交由北京擎科新业生物技术有限公司合成, 引物序列见表1。反应体系为:2× Taq Plus Master Mix 10 μ L, 上下游引物各0.8 μ L, SYBR Green Ⅰ 1 μ L, ddH2O 6.4 μ L, cDNA模板1 μ L。反应条件为:94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 40个循环; 延伸10 min; 熔解曲线从65 ℃到95 ℃, 每5 s升高0.5 ℃。
表1Table 1表1(Table 1) 表1 实时荧光定量PCR引物信息 Table 1 Primer information of real-time fluorescence quantitative PCR detection基因Gene引物序列Primer sequences(5'→ 3')产物长度Productlength/bp退火温度Annealingtemperature/℃GNASF: TCATACGAGAGGACAATCAGR: TCATCTGGTGTAGTGTAGC20260β -ActinF: CGTGACATCAAGGAGAAGR: GAAAGATGGCTGGAAGAG17159 表1 实时荧光定量PCR引物信息 Table 1 Primer information of real-time fluorescence quantitative PCR detection1.6 GNAS基因CDS区克隆与分析根据NCBI数据库日本鹌鹑和原鸡GNAS基因的保守序列设计2对引物(表2)。反应体系为:1.1× T3 Super PCR Mix 17.6 μ L, 上下游引物各0.7 μ L, 模板cDNA 1 μ L。反应条件为:94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性15 s, 退火15 s, 72 ℃延伸15 s, 36个循环; 最后72 ℃延伸10 min。得到的PCR产物经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收, 经过胶回收的产物测序后运用SeqMan软件对序列信息进行拼接获得完整的CDS区序列。回收后的产物连接到pMD-19T质粒载体后, 转化到大肠埃希菌感受态细胞中, 于恒温培养箱37 ℃条件下培养8 h, 蓝白斑筛选后, 选取阳性菌落进行PCR鉴定检测, 将鉴定为阳性的菌落送北京擎科新业生物技术有限公司测序。将测序结果分别与NCBI的基因组进行BLAST分析, 用ExPASy预测蛋白序列编码氨基酸、等电点与分子质量等。使用MEGA 7.0软件对朝鲜鹌鹑进行生物种属间比对, 生成系统进化树。
表2Table 2表2(Table 2) 表2 GNAS基因CDS区引物设计 Table 2 Primer design of CDS region of GNAS gene基因Gene引物序列Primer sequences(5'→ 3')产物长度Productlength/bp退火温度Annealingtemperature/℃GNAS-1F: AATAGTGACAGCAATGGGCR: GAAAAAGTTGAGGGGTGC1 00153GNAS-2F: AGATGGGCTGCTTAGGGAACR: GCTTTCACACCGTCATCTTGC43959 表2 GNAS基因CDS区引物设计 Table 2 Primer design of CDS region of GNAS gene1.7 朝鲜鹌鹑GNAS基因多态性检测 1.7.1 GNAS基因的不对称PCR扩增
采用克隆获得的朝鲜鹌鹑GNAS基因序列设计外显子12部分引物, 参考NCBI数据库中的日本鹌鹑GNAS基因序列信息设计3’ 非编码区部分引物, 用Primer 5.0软件设计出2对引物, 由北京擎科新业生物技术有限公司合成(表3)。
表3Table 3表3(Table 3) 表3 朝鲜鹌鹑GNAS基因引物序列信息 Table 3 Sequence information of primers of GNAS gene in Korean quail基因Gene引物序列Primer sequences(5'→ 3')退火温度Annealing temperature/℃扩增片段Product positionGNAS-3F: CAAGTGACCAGATGTTGCAGCR: TGGAAGTGGAGGTTGGTGG59外显子12部分片段Part of exon 12GNAS-4F: CACTTGAGTTTGGCTCTGACR: CTCTTTCTGCGATCACAGG533’ 非编码区部分片段Part of 3'UTR region 表3 朝鲜鹌鹑GNAS基因引物序列信息 Table 3 Sequence information of primers of GNAS gene in Korean quail采用不对称PCR进行扩增, 以提取的基因组DNA为模板, 等浓度引物进行PCR扩增, 扩增出目的片段的双链, 检测产物质量; 再以PCR产物作为模板, 利用其中的任意1条引物进行第2次PCR扩增, 扩增出目的片段的单链。外显子12部分片段的第1次PCR扩增反应体系为:基因组DNA 1 μ L, 1.1× T3 Super PCR Mix 17.6 μ L, 上下游引物各0.7 μ L; PCR扩增反应条件:95 ℃预变性4 min; 95 ℃变性15 s, 59 ℃退火15 s, 72 ℃延伸15 s, 36个循环; 72 ℃延伸10 min。1.8%琼脂糖凝胶电泳检测产物, 得到目的条带后进行第2次PCR扩增。第2次PCR扩增反应体系为:第1次PCR扩增产物1 μ L, 1.1× T3 Super PCR Mix18.3 μ L, 上游引物0.7 μ L, 反应条件同第1次PCR, 循环数调整至20个。3'UTR部分扩增的反应体系和反应条件除退火温度为59 ℃外, 其他与外显子12部分一致。
1.7.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳与分析
取1 μ L SYBR Green II RNA染料加入1 mL灭菌双蒸水中混合, 再加入1 mL 6× Loading buffer缓冲液与其混匀, 取5 μ L上述工作液加入到20 μ L电泳样品中, 94 ℃变性使两者充分结合。取8 μ L混合液, 于常温下浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳, 185 V电泳10 min后转换为85 V继续电泳8 h, 结束后在凝胶成像仪上进行拍照保存。通过电泳结果对单链构象多态性(single strand conformation polymorphism, SSCP)分析, 相同基因型对应个体各选取3份PCR扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。测序结果使用DNAMAN软件和Ensembl网站进行对比分析, 以确定突变位点。根据基因型统计结果, 计算基因型频率、基因频率和多态信息含量(polymorphic information content, PIC), 采用卡方检验检测朝鲜鹌鹑群体是否处于Hardy-Weinberg平衡。
1.8 数据的统计学分析用2-Δ Δ Ct法计算相对表达量, 运用SPSS 20.0进行样本t检验, Graphpad Prism 8.0软件作图, 用SPSS 20.0的χ 2检验SNP位点与羽色性状的关联性和群体Hardy-Weinberg平衡。
2 结果与分析2.1 总RNA和基因组DNA质量检测经超微量分光光度计检测, 提取的总RNA的浓度在2 000~3 500 ng· μ L-1, A260/A280均在2.0左右, A260/A230均在2.2左右。1.2%琼脂糖凝胶检测如图1, 可清晰看到28S、18S、5S 3条带, 表明所提取的总RNA质量良好。
图1Fig.1Figure OptionViewDownloadNew Window 图1 总RNA凝胶成像1~5:RNA验证结果。Fig.1 Gel imaging of total RNA1-5:RNA verification results.
对提取的基因组DNA检测, A260/A280均在1.9左右, A260/A230均在2.2左右。0.8%琼脂糖凝胶检测如图2, 条带清晰明亮且长度符合DNA要求, 表明所提取的DNA质量良好。
图2Fig.2Figure OptionViewDownloadNew Window 图2 基因组DNA凝胶成像1~5:DNA验证结果。Fig.2 Gel imaging of genomic DNA1-5:DNA verification results.
2.2 GNAS基因mRNA表达水平朝鲜鹌鹑不同发育阶段胚胎中GNAS基因mRNA相对表达水平见图3。如图所示, GNAS基因在朝鲜鹌鹑胚胎发育至6 d时的表达水平低于发育到8~14 d; 当发育至8 d时, 表达量达到最高; GNAS基因在栗羽鹌鹑胚胎组织中的表达水平整体高于白羽朝鲜鹌鹑, 其中胚胎发育到8~14 d时, GNAS基因在栗羽鹌鹑胚胎组织中的表达水平极显著(P< 0.01)高于白羽鹌鹑。
图3Fig.3Figure OptionViewDownloadNew Window 图3 朝鲜鹌鹑不同发育阶段胚胎中GNAS基因mRNA相对表达水平* * 表示相同发育阶段不同羽色鹌鹑胚胎间差异极显著(P< 0.01)。Fig.3 Relative expression of GNAS gene mRNA in different developmental stages of Korean quail embryos* * means great significant difference(P< 0.01) between different plumage color Korean quail embryos at same developmental stage.
2.3 GNAS基因CDS区克隆及序列分析GNAS基因CDS区的PCR扩增结果如图4所示, 其片段大小分别为1 001、439 bp, 产物条带清晰, 可以用于DNA测序分析。测序结果经BLAST比对, 成功获得GNAS基因CDS区完整序列(GenBank No. MT649634), 其中开放阅读框(open reading frame, ORF)长1 140 bp。GNAS基因位于鹌鹑20号染色体上, 有14个外显子, 编码的蛋白含379个氨基酸, 等电点6.43, 分子质量为44 399.47 Da, 带正电荷氨基酸残基数为54, 带负电荷氨基酸残基数为56, GRAVY值为-0.593, 该蛋白为稳定亲水性蛋白。
图4Fig.4Figure OptionViewDownloadNew Window 图4 朝鲜鹌鹑GNAS基因CDS区产物的电泳检测M:DNA marker 2 000; 1~2:CDS区扩增产物。Fig.4 Electrophoresis detection of PCR product of GNAS CDS in Korean quailM: DNA marker 2 000; 1-2: CDS region amplification products.
2.4 GNAS基因编码蛋白的系统进化分析由图5可知, 朝鲜鹌鹑GNAS基因编码蛋白与日本鹌鹑和原鸡同源性最高, 表明GNAS基因在物种进化过程中保持了较高的保守性。
图5Fig.5Figure OptionViewDownloadNew Window 图5 基于GNAS蛋白的朝鲜鹌鹑种属间系统进化树Fig.5 Interspecific phylogenetic tree of Korean quail based on the protein of GNAS
2.5 GNAS基因特定序列PCR扩增产物检测图6为不同羽色朝鲜鹌鹑GNAS基因外显子12和3'UTR的PCR扩增结果。外显子12片段扩增长度254 bp, 3'UTR的扩增产物长度为190 bp, 产物条带清晰且无杂带, 可以用于回收测序。
图6Fig.6Figure OptionViewDownloadNew Window 图6 朝鲜鹌鹑GNAS基因外显子12和3'UTR PCR产物电泳1~4、9~12:栗羽鹌鹑PCR扩增产物; 5~8、13~17:白羽鹌鹑PCR扩增产物; M:DNA marker 2 000。Fig.6 Electrophoresis detection of PCR product of exon 12 and 3'UTR in GNAS gene of Korean quail1-4, 9-12: PCR amplification products of maroon plumage quail; 5-8, 13-17: PCR amplification product of white plumage quail; M: DNA marker 2 000.
2.6 GNAS基因型分析经PCR-SSCP分析, GNAS基因外显子12和3'UTR均有3种基因型(图7)。图中, 左侧是外显子12基因型, 右侧为3'UTR基因型。
图7Fig.7Figure OptionViewDownloadNew Window 图7 朝鲜鹌鹑GNAS基因扩增产物不对称PCR-SSCP分析Fig.7 Genotypes of GNAS gene in Korean quail by ASPCR-SSCP analysis
分别选取外显子12和3'UTR的3种基因型个体PCR产物进行测序。如图8所示, 外显子12区域和3'UTR区域均有1个突变位点, 分别是g.119221T> A和g.121181A> G。
图8Fig.8Figure OptionViewDownloadNew Window 图8 朝鲜鹌鹑GNAS基因的突变检测Fig.8 Detections of GNAS mutation in Korean quail
2.7 突变位点遗传信息分析如表4所示, 朝鲜鹌鹑群体中GNAS基因的g.119221T> A的优势等位基因为B, 优势等位基因频率为0.75; g.121181A> G突变位点的优势等位基因是A, 频率为0.71。通过对朝鲜鹌鹑群体多态信息含量计算可知, GNAS基因的2个突变位点均表现为中度多态(0.25< PIC< 0.5)。对朝鲜鹌鹑GNAS基因的2个多态位点进行Hardy-Weinberg平衡检验, 朝鲜鹌鹑群体在2个突变位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P> 0.05)。
表4Table 4表4(Table 4) 表4 不同基因型群体分析 Table 4 The genotypes in different SNP loci位点Loci基因型频率Genotypic frequencies等位基因频率Allele frequencies多态信息含量PICHardy-Weinberg平衡Hardy-Weinberg equilibriumAAABBBABχ 2Pg.119221T> A0.0800.3470.5730.250.750.372.0990.147g.121181A> G0.5120.3900.0930.710.290.310.7410.389 表4 不同基因型群体分析 Table 4 The genotypes in different SNP loci2.8 GNAS基因多态性与羽色性状的关联分析如表5所示, 在g.119221T> A位点, 栗羽朝鲜鹌鹑3种基因型的频率分布与白羽朝鲜鹌鹑差异不显著(P> 0.05); 在g.121181A> G突变位点, 栗羽朝鲜鹌鹑的3种基因型的频率分布与白羽朝鲜鹌鹑差异极显著(P< 0.01), 等位基因A能显著提高羽色沉积度, 其中AA基因型个体> AB基因型个体> BB基因型个体。由此可以推断, GNAS基因3'UTR的g.121181A> G突变位点与朝鲜鹌鹑羽色性状具有关联性。
表5Table 5表5(Table 5) 表5 朝鲜鹌鹑GNAS基因多态性与羽色性状的相关性分析 Table 5 The relationships of genotypes of GNAS gene with plumage color traits in Korean quail位点Loci羽色表型Phenotype总样本量Totalnumbers基因型频率Frequencies of each genotype等位基因频率Allele frequenciesχ 2PAAABBBABg.119221T> A栗羽 Maroon2900.193(56)0.359(104)0.448(130)0.370.630.8900.640白羽 White2860.238(68)0.329(94)0.433(124)0.400.60g.121181A> G栗羽 Maroon2940.490(144)0.410(122)0.095(28)0.700.3012.2890.002白羽 White2880.479(138)0.285(82)0.236(68)0.620.38χ 2:卡方检验; P:概率。
χ 2: Chi-squared test; P: Probability.
表5 朝鲜鹌鹑GNAS基因多态性与羽色性状的相关性分析 Table 5 The relationships of genotypes of GNAS gene with plumage color traits in Korean quail3 讨论羽色的遗传效应是近年来许多学者研究的重点。类胡萝卜素类色素和黑色素类色素是沉积在皮肤中的2种主要色素, 其相互影响形成了动物界丰富多彩的颜色。类胡萝卜素类色素主要沉积在皮肤和卵巢中[8]; 真黑色素和褐黑素统称黑色素, 主要存在于黑色素细胞中, 黑色素细胞主要分布于结缔组织、骨骼以及骨膜等各种组织中[9], 黑色素细胞在真皮层和表皮层沉积的位置不同对肤色影响也不尽相同[10]。
在黑色素皮质素代谢途径中, MC1R与配体结合后被激活, 催化产生第二信使cAMP, 促进真黑素的形成[4]。当黑色素细胞中的MC1R含量不足或者活动受阻时, 黑色素的含量就会减少, 动物的皮肤等颜色就表现为浅色[11, 12]。本研究结果表明, GNAS基因在栗羽朝鲜鹌鹑组织中表达水平高于白羽朝鲜鹌鹑, 与赵新[14]提出的GNAS基因mRNA在黑色绵羊皮肤中表达水平极显著高于白色绵羊皮肤组织的观点一致。GNAS基因在朝鲜鹌鹑胚胎发育至8 d时表达量达到最大, 此时该基因处于活跃时期, 催化激活第二信使并促进真黑素的合成, 当色素的合成和沉积达到一定水平后会影响到动物的肤色表型。朝鲜鹌鹑GNAS基因的CDS区序列与其他物种同源性对比, 发现GNAS基因CDS区序列与日本鹌鹑和原鸡等禽类具有非常高的同源性, 在系统发育树上先聚合, 紧接着与哺乳类以及其他物种再聚合, 反映出GNAS基因编码蛋白存在着物种间的差异但同时保持了高度保守性。
据报道, 与GNAS同属一个家族的GNAQ和GNA11基因的变异与恶性黑色毒瘤的发生有密切的相关性[14, 15], 说明基因在体内黑色素细胞的代谢通路中, 发挥着重要作用。Weinstein等[3]报道, McCune-Albright综合征患者的GNAS基因第8外显子产生了错义突变, 造成皮肤黑色素增多并出现咖啡样色素斑。同时人的GNAS基因的第5外显子上的突变位点与黑色素瘤、膀胱癌以及肺癌等恶性肿瘤患者的生存期显著相关[16, 17]。通过以上报道可以得知GNAS基因与黑色素的形成有密切的关系。本次试验在朝鲜鹌鹑GNAS基因上检测到了2个SNP位点, 2个突变位点均表现为中度多态, 且都处于Hardy-Weinberg平衡状态。由于体内的黑色素形成和作用机理异常复杂, 因此, 在这一过程中黑色素的合成和沉积, 以及GNAS基因的表达和变异都会对羽色多样性产生影响。经对比可看出这2个SNP位点均未能引起氨基酸的改变, 但外显子12区域的g.119221T> A突变为同义突变, 可能会引起RNA结构发生变化进而导致立体结构改变而影响其理化性质, 从而可能会影响后续的转录和翻译过程[18]; 目前对于MicroRNA的研究集中在3'UTR区域[19], 本试验的3'UTR区域的g.121181A> G的突变位点与MicroRNA结合有关, 进而会影响基因转录活性等变化。在g.121181A> G突变位点, 栗羽朝鲜鹌鹑3种基因型的频率分布与白羽朝鲜鹌鹑差异极显著(P< 0.01), 等位基因A能显著提高羽色沉积度, 说明该突变位点与朝鲜鹌鹑羽色性状具有一定的关联性。
(责任编辑 万晶)
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[本文引用:1]
1
2008
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... 黑色素的数量、性质与分布是导致家禽羽色多样性的重要原因[1] ...
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2012
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... 真黑素包括黑色和褐色,褐黑素包括黄色和红色,2种黑色素之间的相互转化影响羽色的形成[2] ...
2
2004
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... 亚基(guanine nucleotide-binding protein Gs subunit alpha,GNAS)是位于细胞膜内侧的一类信号传导蛋白,参与细胞的多种生命活动[3] ...
... Weinstein等[3]报道,McCune-Albright综合征患者的GNAS基因第8外显子产生了错义突变,造成皮肤黑色素增多并出现咖啡样色素斑 ...
2
2000
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... 在黑色素代谢通路中,GNAS与黑素皮质素受体1(melanocortin receptor-1,MC1R)通过跨膜结构结合,激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,ADCY),催化ATP产生第二信使,影响细胞内黑色素的合成[4] ...
... 在黑色素皮质素代谢途径中,MC1R与配体结合后被激活,催化产生第二信使cAMP,促进真黑素的形成[4] ...
1
2016
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王欢欢, 陈美玲, 楼立峰, 等. 鸡 GNAS 基因启动子突变及其与肤色性状的相关性[J]. 畜牧兽医学报, 2016, (12): 2354-2361. WANG H H, CHEN M L, LOU L F, et al. GNAS Gene Promoter Mutation in Chicken and the Correlation with Skin Color Traits[J]. Acta Veterinaria et Zootechinca Sinica, 2016, (12): 2354-2361. (in Chinese with English abstract)
The study aimed to investigate the mutation of GNAS gene and its effect on skin color traits in chicken. Dongxiang Blue-eggshell chicken ( Gallus gallus domestica ) was chose and the GNAS mutation sites related to skin color were screened using PCR-restriction length polymorphism (RFLP) and DNA sequencing in this study. We detected expression of the EDN 3, MC 1 R , GNAS and ADCY 3 genes using fluorescence quantitative PCR, and the mutation sites among 3 chicken breeds. The results showed that there was a T/C mutation at base 11 167 660 on chicken chromosome 20 and the mutation (T2270C) was crucial for the GNAS gene promoter. After Dra I enzyme digestion for PCR products, the CC homozygous genotype, the TC heterozygous genotype and the TT recessive homozygous genotype presented one band at 342 bp, two bands at 171 and 342 bp, and one band at 171 bp, respectively. The L values of skin color were statistically significantly different among 3 genotypes ( P ＜0.01). The individuals with CC genotype had the lowest L value, which presented the darkest skin, and the individuals with TT genotype had the highest L value, which presented the lightest skin. Expression of the EDN 3 gene was highest and lowest in individuals with the CC and TT genotype, respectively, and the difference among 3 genotypes was extremely significant ( P ＜0.01). Expression of the MC 1 R , GNAS and ADCY 3 genes was highest in individuals with CC genotype, but the difference among genotypes was not significant ( P ＞0.05). The correlation of GNAS with MC 1 R was non-significant in expression, and the correlation with ADCY 3 was extremely significant ( P ＜0.01). The typing results according to mutation detection in Jiangshan Black-bone chicken, ISA layer, test-crossing offspring of Dongxiang Blue-eggshell cock and ISA hen, conformed to the theoretical values ( P ＞0.05). The study indicate that the T2270C mutation in GNAS gene promoter in chicken is correlated strongly with the skin color traits, and detection of the mutation can be used in the breeding of black-bone chicken.
（1. Hangzhou Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310024，China； 2.Zhejiang Guangda Poultry Breeding Company，Haining 310016，China）
为研究鸡 GNAS 基因突变情况及其对乌骨鸡肤色的影响，本试验选择东乡绿壳蛋鸡样本，采用PCR-RFLP和DNA测序方法，筛查肤色相关的 GNAS 突变位点；采用荧光定量PCR方法，检测 EDN 3、 MC 1 R 、 GNAS 、 ADCY 3基因的表达量；本试验还对3个鸡种进行了突变检测。结果显示，在家鸡20号染色体的11 167 660碱基位置存在T/C突变，该T2270C突变点是 GNAS 基因启动子的关键位点。PCR产物经 Dra I酶切电泳后，CC纯合基因型出现一条342 bp的条带；TC杂合基因型出现171和342 bp两条带；TT隐性纯合基因型出现一条171 bp的条带。3种基因型的肤色L值差异极显著（ P ＜0.01），CC基因型的L值最小，表现为肤色最深；TT基因型的L值最大，表现为肤色浅白。 EDN 3基因的表达量以CC基因型最高，TT基因型最低，3种基因型间差异极显著（ P ＜0.01）。 MC 1 R 、 GNAS 和 ADCY 3基因的表达量以CC基因型最高，但基因型间的表达差异均不显著（ P ＞0.05）； GNAS 与上游 MC 1 R 基因的表达量无显著相关性，而与下游 ADCY 3基因的表达量极显著相关（ P ＜0.01）。江山乌骨鸡、伊莎蛋鸡、东乡×伊莎测交组合鸡的突变分型结果符合理论值（ P ＞0.05）。本研究表明，鸡 GNAS 基因启动子T2270C突变与肤色性状强相关，突变检测可辅助用于乌骨鸡的肤色分型育种。
... GNAS基因是影响乌骨鸡黑色素沉积的候选基因,该基因位于20号染色体Fm区域的拷贝数重复区(copy number variations,CNVs)内,与黑色素的沉积密切相关[5] ...
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2010
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... 已有学者发现,GNAS基因突变可能会导致人类患黑色素瘤病[6,7] ...
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2013
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... 已有学者发现,GNAS基因突变可能会导致人类患黑色素瘤病[6,7] ...
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2016
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... 类胡萝卜素类色素主要沉积在皮肤和卵巢中[8] ...
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2003
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... 真黑色素和褐黑素统称黑色素,主要存在于黑色素细胞中,黑色素细胞主要分布于结缔组织、骨骼以及骨膜等各种组织中[9],黑色素细胞在真皮层和表皮层沉积的位置不同对肤色影响也不尽相同[10] ...
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2010
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... 真黑色素和褐黑素统称黑色素,主要存在于黑色素细胞中,黑色素细胞主要分布于结缔组织、骨骼以及骨膜等各种组织中[9],黑色素细胞在真皮层和表皮层沉积的位置不同对肤色影响也不尽相同[10] ...
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2012
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... 当黑色素细胞中的MC1R含量不足或者活动受阻时,黑色素的含量就会减少,动物的皮肤等颜色就表现为浅色[11,12] ...
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2013
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... 当黑色素细胞中的MC1R含量不足或者活动受阻时,黑色素的含量就会减少,动物的皮肤等颜色就表现为浅色[11,12] ...
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2016
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2009
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... 本研究结果表明,GNAS基因在栗羽朝鲜鹌鹑组织中表达水平高于白羽朝鲜鹌鹑,与赵新[14]提出的GNAS基因mRNA在黑色绵羊皮肤中表达水平极显著高于白色绵羊皮肤组织的观点一致 ...
... 据报道,与GNAS同属一个家族的GNAQ和GNA11基因的变异与恶性黑色毒瘤的发生有密切的相关性[14,15],说明基因在体内黑色素细胞的代谢通路中,发挥着重要作用 ...
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2013
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... 据报道,与GNAS同属一个家族的GNAQ和GNA11基因的变异与恶性黑色毒瘤的发生有密切的相关性[14,15],说明基因在体内黑色素细胞的代谢通路中,发挥着重要作用 ...
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2005
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... 同时人的GNAS基因的第5外显子上的突变位点与黑色素瘤、膀胱癌以及肺癌等恶性肿瘤患者的生存期显著相关[16,17] ...
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2012
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... 同时人的GNAS基因的第5外显子上的突变位点与黑色素瘤、膀胱癌以及肺癌等恶性肿瘤患者的生存期显著相关[16,17] ...
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2015
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... A突变为同义突变,可能会引起RNA结构发生变化进而导致立体结构改变而影响其理化性质,从而可能会影响后续的转录和翻译过程[18] ...
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2009
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... 目前对于MicroRNA的研究集中在3'UTR区域[19],本试验的3'UTR区域的g ...